李丹1，李柏昌2，范艷艷3

　　1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院醫(yī)保科，吉林長春130041;

　　2.長春市醫(yī)療保險(xiǎn)管理中心藥監(jiān)部，吉林長春130062;

　　3.吉林大學(xué)第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，吉林長春130021

　　【摘要】目的探討空氣負(fù)離子對(duì)體外培養(yǎng)的肝癌smmc-7721細(xì)胞生物學(xué)活性的影響。方法將細(xì)胞隨機(jī)分成3組：陰性對(duì)照組、空氣對(duì)照組及負(fù)離子治療組。治療組根據(jù)空氣負(fù)離子作用時(shí)間分成1h組、2h組、4h組和8h組。對(duì)所有細(xì)胞進(jìn)行tunel染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的周期變化應(yīng)用westernbl ot方法檢測(cè)磷酸化p3 8mapk的表達(dá)變化。結(jié)果 與陰性對(duì)照組和空氣對(duì)照組比較，空氣負(fù)離子治療組細(xì)胞凋亡率明顯增加，s期細(xì)胞所占有的比例明顯下降，磷酸化p38mapk表達(dá)明顯上升，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。結(jié)論 空氣負(fù)離子通過細(xì)胞周期阻滯而使腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，這種效應(yīng)是通過p38mapk這條信號(hào)通路傳導(dǎo)的。

　　【關(guān)鍵詞】肝癌;空氣負(fù)離子;p38mapk

　　【中圖分類號(hào)】r 7 3 5. 7【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】a【文章編號(hào)】1001-5256(2008)05-0358-03

　　已有實(shí)驗(yàn)證明空氣負(fù)離子可以參與調(diào)節(jié)大腦皮質(zhì)興奮與抑制過程、改善睡眠、降低血壓、加強(qiáng)氣管粘膜細(xì)胞纖毛運(yùn)動(dòng)、增加基礎(chǔ)代謝率、增進(jìn)食欲、增強(qiáng)機(jī)體抵抗力及抗腫瘤等作用。但是所有實(shí)驗(yàn)幾乎都是流行病學(xué)方面的調(diào)查，到目前為止尚沒有人觀察在實(shí)驗(yàn)室中利用人工產(chǎn)生的空氣負(fù)離子對(duì)體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)作用的影響，我們此次觀察體外培養(yǎng)的人肝癌smmc-772l細(xì)胞在直接與空氣負(fù)離子接觸后的一系列生物學(xué)變化，現(xiàn)報(bào)告如下。

　　l材料與方法

　　1.1 細(xì)胞及主要試劑肝癌細(xì)胞株smmc-772l系溫州醫(yī)學(xué)院病理科惠贈(zèng)，在含10%胎牛血清的rpmi—1640培養(yǎng)液，37℃、5%c02條件下進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞傳代用胰酶消化液(0.25%胰酶，0.02%edta)消化。碘化丙啶(p1)為美國sigma公司產(chǎn)品。tunel細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒為德國boehringer mannheim公司產(chǎn)品。鼠抗

　　人單克隆抗體p38mapk及p38mapk特異性抑制劑sb203580均是美國oncogene公司產(chǎn)品。sb203580使用終濃度為50umol/l。采用特制空氣負(fù)離了發(fā)生器，空氣負(fù)離子檢測(cè)裝置采用瑞典model i-2000型空氣負(fù)離子檢測(cè)器。

　　1.2實(shí)驗(yàn)方法

　　1.2.1 細(xì)胞分組 將培養(yǎng)為對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞隨機(jī)分成3組，即陰性對(duì)照組、空氣對(duì)照組、負(fù)離子治療組。治療組根據(jù)空氣負(fù)離子作用時(shí)間分成1h組、2h組、4h組和8h組。對(duì)照組只給予普通空氣做對(duì)照，空氣負(fù)離子給予方法應(yīng)用自制的可以在孵箱中持續(xù)給予空氣負(fù)離子而不至于對(duì)細(xì)胞的生長產(chǎn)生影響的設(shè)施，將孵箱改造成相對(duì)密閉的空間，空氣負(fù)離子可以通過電離持續(xù)不斷的產(chǎn)生，電壓維持在30.0kv，應(yīng)用空氣離子檢測(cè)器來檢測(cè)空氣負(fù)離子濃度，在實(shí)驗(yàn)前保證空氣負(fù)離子濃度不高于500/cm3，電離后維持空氣負(fù)離子濃度在(2-3)×106/cm3rm。。

　　1.2.2 tunel染色將5-l0代細(xì)胞用胰蛋白酶消化，制成密度為(104-lo5)/ml的細(xì)胞懸液。滴加細(xì)胞懸液于蓋玻片上，1h后，細(xì)胞貼壁，補(bǔ)加培養(yǎng)基。待細(xì)胞生長達(dá)50%-60%，用無血清dmem培養(yǎng)液洗2次，再加條件培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)(24-48)h，收集蓋玻片并應(yīng)用4%多聚甲醛固定，爬片制作成功后進(jìn)行如下染色步驟：

　　①梯度乙醇水化;

　?、?ml/l h2o2封閉30min;

　?、?0mg/l蛋白酶k消化液作用20min;

　　④tunel反應(yīng)液，37℃孵育60min;

　?、葸^氧化物酶連接的抗熒光素抗體，37℃孵育30min;②～⑤步后均以10mmol/l pbs(ph 7.4)振洗3次，每次5min;

　?、辒ab顯色，蘇木素復(fù)染，脫水透明，封片。以pbs替代tunel反應(yīng)液作陰性對(duì)照，陽性對(duì)照爬片經(jīng)dnase i預(yù)處理10min，再接tunel染色步驟。結(jié)果判定：光鏡下觀察tunel染色爬片的顯色反應(yīng)，數(shù)5個(gè)以上高倍視野，不少于1000個(gè)細(xì)胞，重復(fù)5次。細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為tunel陽性細(xì)胞，即凋亡細(xì)胞。記數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)并以百分?jǐn)?shù)表示，作為細(xì)胞凋亡指數(shù)。

　　1.2.3 應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期分析收集消化的貼壁細(xì)胞，pbs沖洗后重懸在4℃、70%的乙醇中至少(1-2)h，以1000r/min離心細(xì)胞后重懸在含100mg/l rna酶和10mg/l碘化丙啶的pbs中，25c暗處孵育15min。用facscali-bur流式細(xì)胞儀進(jìn)行單色熒光細(xì)胞流式計(jì)數(shù)。結(jié)果用multiplus software ii軟件分析數(shù)據(jù)，每個(gè)樣本收集10000個(gè)細(xì)胞，重復(fù)3次。

　　1.2.4 western blot方法檢測(cè)空氣負(fù)離子作用前后磷酸化p38mapk的蛋白表達(dá)，取體外培養(yǎng)的l×107-8個(gè)7721細(xì)胞在1mlripa裂解緩沖液中勻漿提取蛋白，測(cè)定提取的蛋白濃度。每個(gè)上樣孔加樣30ug蛋白，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜后雜交，一抗為山羊抗人磷酸化p38map單抗(santa cruz公司，l：400)，二抗為hrp標(biāo)記兔抗山羊igg抗體(santa cruz公司，l：4000)，ecl顯色(amersham公司)，拍照，密度掃描測(cè)各條帶吸光度(ia)。以ia(目的條帶/β-actin對(duì)照條帶)，表達(dá)各標(biāo)本上述蛋白含量，共重復(fù)10次。

　　1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用spssl3.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用(x±s)表示，采用t檢驗(yàn)。

　　2結(jié)果

　　2.1 各組細(xì)胞凋亡率，s期占有率及p38mapk的la值見表1

　　3討論

　　空氣負(fù)離子被喻為空氣維生素，因其對(duì)人體健康有利而吸引科學(xué)界的目光。對(duì)空氣負(fù)離子的研究開始于十九世紀(jì)五十年代，已經(jīng)證明空氣負(fù)離子有調(diào)整大腦皮質(zhì)興奮與抑制過程、改善睡眠、降低血壓、加強(qiáng)氣管粘膜細(xì)胞纖毛運(yùn)動(dòng)、增加基礎(chǔ)代謝率、增進(jìn)食欲、增強(qiáng)機(jī)體抵抗力等作用。醫(yī)學(xué)家研究表明，空氣負(fù)離了對(duì)人體的保健作用和輔助療效大小與空氣負(fù)離子濃度有關(guān)。當(dāng)空氣負(fù)離子濃度達(dá)到700個(gè)·cm3以上時(shí)才有益于人休健康：當(dāng)濃度達(dá)到l萬個(gè)·cm3以上時(shí)才能治病;當(dāng)負(fù)離子濃度大于或等于正離子濃度時(shí)，才能使人感到舒適，并對(duì)多種疾病有輔助治療作用。但是幾乎沒有體外研究其對(duì)細(xì)胞的直接作用效果及其相關(guān)機(jī)制，空氣中的陽離子使人的神經(jīng)焦慮、緊張，而負(fù)離子卻可以使人放松神經(jīng)和心情，yamada等，研究認(rèn)為空氣負(fù)離子可以降低由高脂飲食而造成高脂血癥的小鼠的紅細(xì)胞的聚集作用，iwama報(bào)道空氣負(fù)離子可以提高紅

　　細(xì)胞的變形能力以及有氧代謝能力。poppery等曾系統(tǒng)研究空氣負(fù)離子的抗腫瘤作用，他將水產(chǎn)生的空氣負(fù)離子和電產(chǎn)生的空氣負(fù)離子做對(duì)比，闡述了空氣負(fù)離子可以抗小鼠的腫瘤的產(chǎn)生和生長，其機(jī)制與其增加小鼠體內(nèi)的nk細(xì)胞的活性有關(guān)，其抗腫瘤作用與其吸入的時(shí)間和劑量成正比，同時(shí)闡明水產(chǎn)生的空氣負(fù)離子較電產(chǎn)生的空氣負(fù)離子效果更加明顯。我們此次實(shí)驗(yàn)通過對(duì)體外培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞觀察空氣負(fù)離子直接作用在細(xì)胞上所產(chǎn)生的生物學(xué)反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)空氣負(fù)離子可以明顯誘導(dǎo)肝癌smmc-7721腫瘤細(xì)胞的凋亡，s期細(xì)胞在各期細(xì)胞中所占有的百分率明顯下降，同時(shí)在細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)表達(dá)的磷酸化的p38mapk明顯增加，其中以負(fù)離子作用時(shí)間4h組最為明顯，與1h和2h組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。加入sb203580后在抑制了p38mapk的同時(shí)也抑制了其他一系列生物學(xué)效應(yīng)。這說明空氣負(fù)離子通過使細(xì)胞周期阻滯而使腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，這種效應(yīng)是通過p38mapk這條信號(hào)通路傳導(dǎo)的

　　4參考文獻(xiàn)略

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空氣負(fù)離子對(duì)癌癥的作用機(jī)理：http://m.xuangzs.cn/neirong.asp?id=757